超分辨率显微镜STORM助力沙门氏菌-宿主相互作用的研究(预约试拍)

由于荧光显微镜的低分辨率和灵敏度以及缺乏观察病原体的超微结构信息，宿主细胞内的胞内病原体的成像变得复杂。在此，作者提出了一种新的方法来观察这些病原体在感染过程中的情况，从而避免了这些问题：通过对胞内病原体鼠伤寒沙门氏菌进行生物正交标记，并通过使用这些生物正交组来引入与随机光学重建显微镜STORM兼容的荧光团，并将其置于相关的光电子显微镜（CLEM）工作流程中，病原体可以在其宿主细胞环境鼠伤寒菌中成像，分辨率为20 nm。因此，STORM-CLEM方法提供了一种了解这些病原体感染过程的新方法。

研究介绍（节选）

抗生素耐药性的上升是全球健康的主要威胁之一。在这方面，一类病原体被证明是特别麻烦的，这类病原体是细胞内细菌。它们通过在宿主细胞吞噬体中驻留和复制而阻碍免疫检测。通过分泌操纵吞噬体成熟的因子，它们确保了它们在细胞内的存活，尽管哺乳动物宿主部署了大量的防御机制，因此，在细胞和分子水平上理解细菌-宿主相互作用是极其重要的。生物正交化学已被证明是研究这些宿主-病原体相互作用的一项重大突破性技术。然而，目前我们试用的标记方法要么需要将对生物正交甲硫氨酸、苯丙氨酸或正亮氨酸类似物具有特异性的突变tRNA/tRNA合成酶对引入病原体以实现所需基团的掺入，要么具有低灵敏度。这就限制了它们仅用于那些技术可用于的细菌菌株。

在过去的几年里，超分辨率成像技术蓬勃发展，实现了纳米级的分辨率。作者在之前研究的基础上，加入了超分辨率显微镜，这将有助于克服与病原体相关的障碍：随机光学分辨率显微镜STORM在实验中灵敏度和改进的分辨率，使荧光信号的分辨率与TEM更接近，并提高检测灵敏度，允许通过CLEM对遗传未修饰的病原菌进行成像。

研究结果（节选）

使用STORM-CLEM进行生命周期研究的一种病原体是鼠伤寒沙门氏菌（以下简称沙门氏菌）。鼠伤寒杆菌或沙门氏菌）。这是一种革兰氏阴性兼性胞内病原体，通过摄取后分泌各种效应蛋白来确保其在胞内存活。它们调节细菌所驻留的吞噬体的成熟，以产生适合其生存和复制的寄生泡。为了将我们的STORM-CLEM应用于沙门氏菌的成像，我们首先评估了我们是否可以通过使用BONCAT将生物正交氨基酸类似物掺入到足够的水平，以允许在被吞噬细胞摄取后对细菌蛋白质组进行ccHc检测，而不影响细菌的生长和感染性。

图1 流式细胞术分析Hp-S.鼠伤寒标记及标记在体外和细胞内的持久性。

鼠伤寒与Met（4 mm）或Hpg（0.04-4 mm）一起孵育，然后进行固定并用Alexa-647-叠氮化物进行ccHc。(B)通过孵育用0.4mmHpg孵育鼠伤寒沙门氏菌30分钟，并在指定时间测量ccHc信号。(C)显示DsRed表达作为细菌总数的测量值(D)显示ccHc信号在0-3 h内持续存在。

我们接下来使用STORM-CLEM方法检测BM-DC内的Hpg-沙门氏菌（图2）。

图2 用Hpg-S处理的BM-DC 75 nm冷冻切片的超分辨率N-STORM-CLEM图像。

鼠伤寒将BM-DC与Hpg-S孵育。用磷酸盐缓冲液洗涤以除去未结合/未内化的S.鼠伤寒将细胞固定并进行Tokuya样品制备，并冷冻切片成75 nm切片。在ccHc条件下（红色），用Alexa-647-叠氮化物处理切片。左图：Hpg-S超分辨率N-STORM成像的示例A）1和B）2。鼠伤寒右图：左侧面板的超分辨率CLEM图像。箭头表示吞噬体外信号。比例尺：250 nm。

结果表明，荧光标记Hpg-S的准确性和检测灵敏度均优于对照组。STORM图像的鼠伤寒沙门氏菌感染率明显高于低分辨率共聚焦图像。随后通过电子显微镜观察细胞内环境显示STORM没有破坏吞噬细胞的超微结构。发现膜是完整的，并且相对于那些没有通过STORM分析的区域，在经过STORM成像的样品区域之间没有观察到结构变化。细胞器根据其独特的形态学外观很容易识别。STORM图像的相关性表明生物正交信号主要在沙门氏菌或寄生液泡周围直径约为10-20 nm的小结构上。

这是第一个使用生物正交组的超分辨率随机光学重建显微镜（STORM）-相关光电子显微镜（CLEM）及其在宿主-病原体相互作用研究中的应用的例子，因此可以用来在空间上详细的宿主环境中观察非转基因病原体。与作者的方法和以前报道的方法相比，STORM的灵敏度甚至允许检测细胞外蛋白产物。这开启了成像病原体的可能性，对于这些病原体，先前的生物正交非规范氨基酸标记（BONCAT）方法是无效的。STORMCLEM与BONCAT、tRNA/tRNA合成酶突变体或生物正交细胞壁标记的组合将对研究这些病原体的体内生命周期有价值。将这一技术应用于生物正交化学已经发生变革的其他领域，也将为这些领域增加一个额外的超微结构维度。

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