Nature子刊：基因编码赋予工程生物材料特性！

天然存在的生物材料，如骨头或木头，由少量的祖细胞自下而上生长成宏观结构。工程生物材料(ELMs)将活细胞嵌入生物聚合物基质中，以创造具有定制功能的材料。虽然宏观ELMs的自底向上装配与从头合成基质将提供对材料性质的最大控制，但缺乏基因编码导致集体自组织的蛋白质基质的能力。基于此，来自美国莱斯大学的Caroline M. Ajo-Franklin团队报道了从新月柄杆菌细胞中生长的ELMs，显示和分泌一种自我相互作用的蛋白质。这项工作提供了遗传工具、设计和组装规则，以及一个平台用于生长具有控制基质和细胞结构和功能的ELMs。这种蛋白质形成了一种全新的基质，并形成了一种规模较大的ELMs。设计和组装原理的发现能够调整这些ELMs的组成、机械性能和催化功能。相关论文“A de novo matrix for macroscopic living materials from bacteria ”于2022年9月21日发表于杂志Nature communications上。

1.宏观自下向上ELM的从头工程

利用现有的新月柄杆菌基因工具，研究团队创建自下而上的工程生物材料(ELMs)，由细胞组成的通过表面结合的从头基质在高密度下相互作用。研究团队设计了一个展示自下而上的新生(BUD)蛋白质的方法，是用编码四个功能区(图1a-底部)的合成结构来取代表层(S层)RsaA(图1a-顶部)的天然复制：(I)用于高密度显示的表面锚定结构域，(II)影响材料性质的生物聚合区，(III)用于功能化的标签，以及(Iv)用于自我相互作用和分泌的结构域。

图1 工程新月柄杆菌菌株自组装成BUD-ELMs

为了将BUD蛋白固定在新月柄杆菌的细胞外表面，作者首先发现了250个RsaA的残基，已知RsaA能以每μm2约14000个拷贝的密度与O-抗原脂多糖结合。对于生物聚合物区域，选择了一种基于人类对流层弹性蛋白的弹性样多肽(ELP)，它包含60个Val-Pro-Gly-X-Gly基序的重复序列(ELP60)。ELPs形成弹性材料，并以浓度依赖性的方式自我关联。因此，该区域被设计用来影响材料的性质，促进溶液的可及性，并增加非共价自相互作用。SpyTag被用作功能化标签，因为它与含有SpyCatcher的融合蛋白共价结合。我们还引入了FLAG标记作为表位标记。最后，选择由RsaA的最后336个残基组成的BUD蛋白的C端结构域来调节蛋白的分泌和自我结合。将这种表达BUD蛋白的新月柄杆菌菌株作为BUD- ELP菌株进行研究。通过这种方式，设计了一个新月柄杆菌菌株，在其整个表面显示一个高密度的、表面结合的、基于弹性蛋白的基质(图1b)。

为了测试BUD-ELM菌株是否能自主形成宏观材料，作者采用标准培养基和标准生长条件对其和野生型菌株进行液体培养。缺乏BUD蛋白的野生型新月柄杆菌在生长24小时后没有产生任何可见的团聚体。相比之下，在相同条件下，BUD- ELM菌株的培养产生了厘米级的丝状物质(图1 -c左)。该材料的干质量产率为350±302 mg /L培养。材料中含有完整的新月柄杆菌细胞(图1c -右)，细胞聚集成块，面积大于50 μm2。

为了探究BUD蛋白是否表面显示并在BUD- ELM组装过程中发挥作用，作者将BUD- ELM品系的浮游细胞外表面与其亲本新月柄杆菌品系在基质形成前的细胞外表面进行了比较。当用SpyCatch -GFP染色时BUD-ELM菌株的细胞(图1d -左)沿细胞外轮廓(黄色)显示GFP荧光(青色)，说明BUD蛋白位于细胞外表面。BUD-ELM未被游离GFP染色(图1d -右)，ΔSpyTag菌株也未被SpyCatch -GFP染色，证实了染色需要SpyTag和SpyCatcher之间的特异性结合。BUD-ELM细胞的原子力显微镜(AFM)显示出刷状结构(图1e -右)，将其与野生型六聚体s层(图1e -左)和ΔrsaA菌株(图1e -中)区分开来。BUD蛋白形成长而非结构化的投影，这一软层介导细胞与细胞之间的相互作用。这些结果表明，通过基因编码的高密度显示BUD蛋白封装了新月柄杆菌。首次展示了宏观的、自下而上的ELMs与介导细胞-细胞相互作用的全新表面结合基质。

2.BUD-ELMs通过合成的蛋白基质分层组织

为了在多个长度尺度上表征BUD-ELMs的结构，研究团队用SpyCatch - GFP对其进行染色，并使用共聚焦显微镜对其成像。在半毫米长度的尺度上(图2a -左)，BUD蛋白(青色)和细胞(黄色)分布在整个材料中。在微米尺度上，材料中的新月柄杆菌细胞显示出一层BUD蛋白(图2a -右)，类似于该菌株的浮游细胞(图1d)。然而，在数十微米长度的尺度上(图2a -中)，作者意外地观察到一个含有BUD蛋白的分泌基质(蓝色)，它局部不均匀，四周被新月柄杆菌细胞(黄色)包围。

为了探测基质组成，研究团队用刚果红和3,3 '双十八烷基氧基高氯酸盐(DiO)对BUD-ELM进行染色。刚果红染色与细胞染色正交，与SpyCatcherGFP染色重叠，证实基质由蛋白质组成。相反，DiO没有染色无细胞区域。DiO染色的缺失排除了BUD-ELM基质含有裂解细胞残留物的假设。对无细胞区和染色区(图2b)的分析证实，与脂质染色相比，蛋白质染色与排除细胞的基质区有更高的重叠。因此，BUD- ELM菌株产生一种含有BUD蛋白的分泌蛋白基质，在数十微米长度范围内介导BUD- ELM结构。

为了了解BUD蛋白是如何在最终的BUD- ELM中作为表面显示和分泌基质结束的，研究团队通过AFM对BUD- ELM形成早期的单细胞进行了成像。在早期(图2c -左)，细胞表面均匀，但在BUD-ELM形成后，细胞显示出较大的突起(图2c -右)。此外，早期BUD-ELM细胞的表层深度约为10 nm(图2d -左)，而晚期细胞的表层深度约为35 nm(图2d -右)，说明蛋白层随着时间的推移而变厚。假设这一层中的BUD蛋白可能随着这一层的增厚而从细胞表面释放，通过对FLAG标记的免疫印迹法检查了BUD- ELM培养的细胞外培养基中BUD蛋白的存在。作者在约102 kDa处观察到一个与BUD蛋白相对应的条带，表明它确实存在于细胞外培养基中。值得注意的是，野生型RsaA迁移的表观分子量比预期的要高(观察到的113 vs.预期的98 kDa)，而BUD蛋白在分子量上也有同样的明显差异(观察到的102 vs.预期的86 kDa)。在静态和振荡条件下，培养基中都有分泌的BUD蛋白(图2e)，这表明部分BUD蛋白释放到培养基中不依赖于振动。尽管如此，这些结果表明，在材料形成过程中，BUD蛋白同时作为表面显示的基质蛋白和分泌的基质蛋白存在。

接下来研究团队试图了解BUD蛋白在装配中的每个结构域的作用。为此，作者生成了一个缺少ELP60的额外菌株(ΔELP60 BUD-ELM菌株，图2f -左面板，顶部图像)，并将其与原始的BUD-ELM菌株(图1a -底部)进行比较。观察到ΔELP60 BUD-ELM菌株(图2f -左面板，左下图)形成的BUD-ELM在形态和颜色上与原始BUD-ELM非常相似，光学显微镜也证实了两者都是富含细胞的材料(图2f左图，底部图像)。此外，共聚焦显微镜显示，尽管去除了中心ELP60结构域，单个细胞仍然被一层BUD蛋白包围。虽然SpyCatch - GFP染色强度较低，但全细胞免疫印迹法表明，ΔELP60细胞上附着的BUD蛋白的数量减少。这表明缺乏ELP60区域的BUD蛋白比原始的BUD蛋白更不易溶于溶剂。综上所述，这些数据表明ELP60结构域促进了BUD蛋白的溶剂可及性。

研究团队还通过使用先前描述的缺乏RsaA1-250但包含ELP60和RsaA690-1026(图2f -右面板，顶部图像)的应变来检查锚定域在材料形成中的作用。在这个ΔrsaA1-250菌株中，BUD蛋白只分泌而不显示，形成了厘米级的基质(图2f -右面板，左下图像)。这些材料的颜色比原始菌株要浅得多，这表明它们含有更少的细胞。事实上，光学显微镜(图2f -右面板，右下图像)显示，这个ΔrsaA1-250 BUD-ELM的细胞比原始的BUD-ELM少得多。总之，这些数据表明，分泌的BUD蛋白关键地实现了厘米级的BUD- ELM组装。另一方面，表面显示的BUD蛋白通过促进细胞-细胞和细胞-基质相互作用，允许丰富细胞的BUD-ELMs的形成。由于作者在原始的BUD-ELM菌株(图1c -左)中观察到与分泌基质(图2a)在空间上不同的大型细胞-细胞聚集，作者认为这种聚集是由高密度蛋白的显示促进的。

因此，这项工作为自主形成的富细胞和富基质的宏观工程活材料提供了遗传设计规则。

图2 BUD-ELMs包含一个新生蛋白基质，并显示出层次结构

3.BUD-ELMs的形成依赖于物理参数的多步骤过程

接下来，研究团队试图通过对生长过程中不同时期的BUD-ELM培养物的成像来了解这种材料是如何组装的(图3a)。摇晃培养物浮游生长约12h(图3a -左)，然后在空气-水界面处出现一层薄膜(图3a -中)。膜的AFM图像描绘了中心的细胞密集区域(图3b -左)和附着在约6nm厚膜上的少量细胞的外围区域(图3b -中和右)，表明BUD蛋白形成了细胞附着的蛋白膜。薄膜的密度和不透明度增加，变得更加致密。总培养时间约24h后，膜层从气-水界面脱附并下沉为最终材料(图3a -右)。通过添加表面活性剂破坏空气/水界面的疏水性，可以防止膜层和材料的形成。当静态培养物被摇晃时，会形成一层膜。这些实验表明，BUD-ELMs是通过多步骤过程形成的，并建立了空气/水界面的疏水性和振动作为BUD-ELMs组装的关键条件。

为了理解并最终预测物理参数如何影响BUD-ELM组装，研究团队在不同条件下在125和250毫升烧瓶中培养，并测量得到的材料的大小。BUD-ELMs的尺寸非单调依赖于振动速度、体积和烧瓶直径(图3c)。为了建立一个现象学模型来描述这一行为，研究团队使用这些参数来计算两个量:体积功率输入PV，描述单位体积的振动提供给烧瓶的能量和体积传质系数kLa，代表氧气进入介质相对于空气-水界面面积的传递。作者发现，这两个参数都与每个烧瓶的BUD-ELMs的大小没有一致的关系。相反，PV、kLa与烧瓶直径的五次方的乘积将培养条件与材料尺寸联系起来。具体来说，该模型将最大块材料的形成与生长在最佳PV,A (0.72-1.65 mW m2/s)范围内的培养相关联。为了测试这个现象模型是否能准确预测在较大烧瓶中生长的材料的尺寸，计算了500ml烧瓶的振动条件，使其与最佳范围内和最佳范围外的PV,A值相匹配，并使用这些条件在500ml烧瓶中生长BUD-ELM培养物。与我们的模型一致的是，在最佳PV,A范围中生长的培养物产生了表观尺寸较大的材料，而在此范围以外的培养则产生更小的物质(图3d)。这一证据表明，最佳PV,A范围可应用于跨不同培养尺寸的大尺寸材料生产，并表明我们的模型可用于扩大BUD-ELM生产的培养。

根据这些数据，研究团队提出了一个BUD-ELM装配模型(图3e)。在培养过程中，新月柄杆菌蛋白在溶液和表面积累。随着摇晃，BUD蛋白吸附在气-水界面上，形成一层越来越厚的富蛋白膜。BUD蛋白显示细胞附着在细胞膜上，增加其密度形成膜。振动产生的水动力会导致薄膜自身塌陷，直到材料沉到烧瓶底部。在较低的PV,A时，较弱的水动力会导致薄的膜层不坍塌，而是逐渐碎裂成更小的材料。在中间PV,A时，更强的水动力使膜塌陷成一个单一的，大的BUD-ELM。在较高的PV,A时，剪切力阻止较大的膜层的组装，导致独立的较小的膜层和较小的最终材料。该经验模型为未来发展描述BUD-ELM装配的机械模型提供了基础。

图3 BUD-ELM是通过一个依赖于振动的多步骤过程形成

4.BUD-ELMs是一种能自我再生的多功能材料，其机械性能可以通过基因调节

由于基质在决定生物材料的力学性能方面起着重要作用，而BUD-ELMs的基质主要由BUD蛋白组成，为了验证对BUD蛋白的遗传操作将对BUD-ELMs的力学性能产生显著影响。研究团队比较了原始的ΔELP60和ΔrsaA1-250 BUD-ELMs的力学性能。流变学测量证实所有三个BUD-ELM都是粘弹性固体。频率扫描曲线显示，在整个角频率测试范围内，三种BUD-ELMs的存储模量(G’)和损耗模量(G″)存在较大且显著的差异。当角频率中心值为10 rad/s时(图4a)，ΔELP60 BUD-ELMs的存储模量比原始BUD-ELM增加了4.4倍，而损耗模量增加了4.0倍。相反，ΔrsaA1-250 BUD-ELMs的G’和G”分别比原始BUD-ELMs低3.2倍和6.3倍。将ΔELP60和ΔrsaA1-250BUD-ELMs进行比较，观察到这些遗传变化可以将存储模量和损耗模量分别调节超过14倍和25倍。我们推测，ΔELP60 BUD-ELMs的刚度增加反映了从形成这种细胞材料的BUD蛋白中移除了一种长弹性连接物ΔELP60。另一方面，我们认为ΔrsaA1-250由于细胞之间以及基质与基质之间缺乏交联，BUD-ELMs的硬度较低。通过对形成基质的BUD蛋白进行基因修饰，可获得25倍以上的机械性能。

ELMs必须能够在加工和储存时不失去再生能力，干燥BUD-ELMs(图4b -左和中)，并将其碎片重新循环到新鲜培养基中(图4b -右)。BUD-ELMs片段干燥7、14或21天后再生形成额外的BUD-ELMs(图4c)。而budd - elms在干燥7或14天后再生100%，而干燥21天的BUD-ELMs在33%的情况下再生。此外，从多种培养物中收集的BUD-ELMs形成了具有粘性的糊状物(图4d -左)，可以通过不同直径的注射器进行挤压(图4d -两个中间图)。当与玻璃粉混合时，BUD-ELMs表现为固定剂，形成更坚固的膏体，硬化为固体复合材料(图4d -右)。这些结果表明，BUD-ELMs在干燥后可以再生，可以重塑，可以加工成复合材料。

最后，作者探讨了BUD-ELMs作为功能材料的能力。能从水中去除重金属的自再生材料有助于解决日益普遍的重金属污染问题。由于许多形式的细菌生物量非特异性地吸收重金属，我们假设BUD-ELM可以从溶液中去除Cd2+。将0.013±0.007 g ΔSpyTag BUDELM与高于环境保护署(EPA)限值的6 ppb -1 pbb的CdCl2溶液孵育90分钟，去除90±5%的镉(图4e)。虽然这种材料的设计没有比野生型新月柄杆菌细胞更大的吸附能力，但数据表明，由于是一种宏观的固体材料，BUD-ELM有潜力成为比单细胞悬浮液更有用的重金属去除工具。

接下来，作者将BUD-ELM基质功能化，使其能够进行生物催化。将氧化还原酶PQQ -葡萄糖脱氢酶(GDH)融合到SpyCatcher上，该酶将葡萄糖的氧化作用耦合到可溶性电子载体的还原上。通过加入辅助因子PQQ(吡罗喹啉醌)重组含有过表达载波SpyCatch -GDH或GDH的细胞裂解液，得到酶的完整形式。观察到，只有与SpyCatch -holo GDH孵育的BUD-ELMs酶降低了电子载体(图4f)。这表明BUD-ELM可以直接从复杂的混合物中功能化，作为催化剂。BUD-ELMs可以作为一种多功能的功能材料。

图4 BUD-ELMs是一种可自我再生、可加工的功能材料

综上，研究团队开发了宏观工程生物材料，可以从工程细菌中自主生长，并可以通过基因编码性能，设想特定的基质特性可以与现有的细胞功能协同结合。具体地说，一种能表达自我相互作用BUD蛋白质形成宏观基质(图1)。当在细胞表面显示时，BUD蛋白介导了细胞-细胞聚集；当被分泌到培养基中时，BUD蛋白形成细胞外基质，将这些聚集体结合成厘米级的结构(图2)。这些ELMs的组装始于工程菌株作为主要浮游培养物的生长，随后形成膜层，并最终分解为最终材料(图3)。对这些设计和组装规则的理解使我们能够将这些ELMs的力学性能改变约25倍，并赋予它们催化性能(图4)。因此，这项工作增加了为人类健康、能源和环境应用量身定做ELM程序的机会。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-33191-2

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