奥维森科技：多种酶高效降解纤维素的组学研究结果

嗜热毁丝霉作为一种高效的纤维素水解微生物，其维持纤维素水解效率的具体机制尚未得到明确揭示。中国农业科学院北京畜牧兽医研究所姚斌院士团队在工程技术期刊《Bioresource Technology》（IF=11.889/Q1）上发表题目为“Deciphering the efficient cellulose degradation by the thermophilic fungus Myceliophthora thermophila focused on the synergistic action of glycoside hydrolases and lytic polysaccharide monooxygenases”的研究论文，揭示了C1/C4氧化型裂解性多糖单氧化酶（LPMO）在未来设计新型纤维素水解酶配方中的潜在应用，以将纤维素有效转化为生物燃料和生物化学品。

奥维森提供了本研究的转录组学测序及分析服务。

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研究背景

木质纤维素是地球上最普遍的可再生物质，由三种主要的天然聚合物组成，包括纤维素、半纤维素和木质素。近几十年来，葡萄糖等聚合物衍生的寡糖一直是生物燃料和生物化学品不可或缺的来源。然而，用于生产低聚糖的酶糖化的成本和效率仍然是限制其商业潜力的主要瓶颈。

嗜热毁丝霉是一种高效且嗜热的木质纤维素降解真菌，分泌各种耐热糖苷水解酶和辅助氧化酶来分解木质纤维素聚合物。值得注意的是，嗜热毁丝霉的比较基因组分析表明，纤维素酶和LPMO的数量都比产纤维素酶的模式真菌里氏木霉的数量更丰富。尽管如此，对纤维素有效降解至关重要的核心酶及其与其他纤维素分解酶的相互作用仍不清楚。

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研究方法

材料：以微晶纤维素作为唯一碳源生长的嗜热毁丝霉

处理：培养1天组（Avi_1d）和培养3天组（Avi_3d），n=3

方法：RNA-seq

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研究结果

1.转录组分析揭示了嗜热毁丝霉中纤维素分解酶的表达谱

为了找出纤维素分解酶对纤维素降解的贡献，在第1天和第3天对以微晶纤维素作为唯一碳源上生长的嗜热毁丝霉进行了转录组测序分析。据报道，嗜热毁丝霉表达各种糖苷水解酶以及编码纤维素解聚基因的辅助氧化酶。约85%（168/198）糖苷水解酶编码基因在纤维素降解的早期被快速诱导表达。其中，纤维素降解相关糖苷水解酶编码基因分布在七个糖苷水解酶家族（GH1、GH3、GH5、GH6、GH7、GH12和GH45）中（图1A）。来自GH5_5（MtCel5A）的纤维素酶和来自GH6（MtCel6A和MtCel6B）及GH7（MtCel7A）编码基因的纤维生物水解酶是糖苷水解酶中最丰富的转录本，表明这些纤维素水解酶可能在纤维素降解中起主导作用。同时，两种β-葡萄糖苷酶形式的GH1（MtBgl1A）和GH3（MtBgl3A）编码基因高度表达，用于纤维寡糖进一步解聚为葡萄糖。约69%（36/52）的辅助氧化酶编码基因在纤维素分解的初始阶段被检测到。有趣的是，36个辅助氧化酶编码基因中有17个属于LPMO的AA9家族。在这些LPMO编码基因中，8个基因（MtLPMO9G、MtLPMO9A、MtLPMO9E、MtLPMO 9I、MtLPMOB9W、MtLPM09H、MtLPMU9B和MtLPMO9 J）高度表达（图1B）。编码MtLPMO9G、MtLPMO9A、MtLPMO9E和MtLPMO9CI的基因是辅助氧化酶最丰富的转录本，这暗示了LPMOs在纤维素解聚中的重要作用。两种纤维二糖脱氢酶（MtCDH1和MtCDH2）编码基因在纤维素降解过程中表现出与LPMO编码基因相似的表达模式和水平（图1B），表明纤维二糖脱氢酶和LPMO之间的协同作用可能是自然界中纤维素氧化降解不可或缺的一部分，因为纤维二糖脱氢酶可以作为实现LPMOs催化功能的电子供体来源。

在本研究中，我们观察到17个AA9 LPMO编码基因和纤维素酶编码基因的共表达，发现8个LPMO基因在微晶纤维素培养基上培养时高度共表达，证实嗜热毁丝霉主要依赖LPMO和传统纤维素酶进行纤维素解聚。

图1 纤维素降解相关糖苷水解酶基因的转录水平

2.纤维素降解关键核心纤维素分解酶的鉴定和表征

考虑到许多编码基因的纤维素分解酶都在微晶纤维素培养中高度表达，很难确定纤维素解聚的核心纤维素分解酶。因此，主要胞外蛋白的肽质量指纹图谱分析和相应的基因敲除菌株研究被用于发现核心纤维素分解酶。最初，通过SDS-PAGE分离嗜热毁丝霉在微晶纤维素培养基上从第1天到第3天生长时产生的细胞外蛋白。在第2天和第3天只观察到两条主要蛋白条带。随后，将第3天的这两条蛋白条带切下并用胰蛋白酶消化，用于肽质量指纹图谱分析，以鉴定相应的蛋白（图2）。结果表明，MtCel7A和MtCel5A是响应嗜热毁丝霉纤维素降解的核心纤维素分解酶。根据先前的转录组图谱，当嗜热毁丝霉在微晶纤维素上培养时，编码MtCel7A和MtCel5A的基因是糖苷水解酶家族中最丰富的转录本。为了进一步评估MtCel7A和MtCel5A对纤维素降解的重要性，分别基于CRISPR-Cas9系统构建了编码基因敲除的MtCel7A与MtCel5A菌株。与野生型相比，嗜热毁丝霉ΔMtCel7A和ΔMtCel5A敲除菌株对微晶纤维素的降解率在第1天分别降低了38%和6%（图3）。这一结果不仅证实了MtCel7A和MtCel5A参与纤维素降解的功能，而且揭示了MtCel6A和MtCel5A对纤维素解聚的重要水平。

根据氨基酸序列比对，MtCel7A和MtCel5A分别是GH7的纤维生物水解酶和GH5_5的内纤维二糖水解酶。这表明MtCel7A和MtCel5A的联合作用是嗜热毁丝霉纤维素解聚的主要策略。值得注意的是，鉴于ΔMtCel7A敲除染色显示微晶纤维素降解显著减少，MtCel7A在纤维素解聚和嗜热毁丝霉利用方面比MtCel5A更重要。该结果与先前的研究一致，即编码基因cbh1的纤维生物水解酶的缺失导致模式真菌里氏木霉和粗糙脉孢菌在微晶纤维素培养基上生长不良，表明可以考虑纤维素生物水解酶的贡献来优化纤维素酶的组成，以实现高效的纤维素降解。

图2 当在微晶纤维素培养基上生长时，通过SDS-PAGE分析嗜热毁丝霉中的细胞外蛋白

图3 嗜热毁丝霉菌株42464、ΔMtCel7A和ΔMtCel5A在第1天对微晶纤维素的降解率

3.核心纤维素裂解酶MtCel7A/MtCel5A和不同类型的MtLPMO在高效纤维素糖化中的协同作用

为了探讨核心纤维素分解酶和辅助氧化酶MtLPMO在纤维素解聚中的相互作用，表达、纯化了MtCel7A、MtCel5A和MtLPMO，并对其进行了微晶纤维素降解表征。鉴于许多LPMO编码基因在微晶纤维素培养基上表达，这些MtLPMO首先根据氧化区域选择性进行分类，并优先选择高表达水平的不同类型的MtLPMO进行表达。如图4所示，基于进化分析，17种表达的MtLPMO分布在C1氧化LPMO、C4氧化LPMO和混合C1/C4氧化LPMO中。其中，三种不同类型的LPMO，包括MtLPMO9E、MtLPMO9kJ和MtLPMO9CH，在毕赤酵母GS115中成功表达，并纯化成单个条带。此外，磷酸溶胀纤维素（PASC）上重组MtLPMO9E、MtLPMO10J和MtLPMO9 H的降解产物证实，它们分别属于C1氧化LPMO、C4氧化LPMO和C1/C4氧化LPMO混合物。

图4 嗜热毁丝霉23个AA9 LPMO家族的进化分析，颜色表明氧化区域特异性

基于这些纯化的重组蛋白，评估了单个核心纤维素裂解酶和不同类型的MtLPMO对微晶纤维素降解的联合作用。对于MtCel7A，MtLPMO9J和MtLPMO9 H的纤维低聚糖产量分别增加了4%和32%，而MtLPMOE的纤维低聚糖生产量减少了14%（图5A）。此外，单个MtLPMO9中没有生成纤维寡糖。关于MtCel5A，MtLPMO9E和MtLPMO9 H将其纤维低聚糖产量提高了12%和97%，而MtLPMO9A将其纤维寡糖产量降低了60%（图5C）。这些结果表明，LPMO对纤维素解聚的核心纤维素分解酶的促进和阻碍作用都存在。

单个核心纤维素裂解酶和不同类型的MtLPMO之间的协同程度值表明，混合物C1/C4氧化MtLPMO9H都提高了MtCel7A和MtCel5A的水解效率，但分别在不同水平上被C1氧化MtLPMO9E和C4氧化MtLPMO 9J抑制（图5B和D）。这些结果表明LPMO的氧化区域选择性与人工纤维素酶混合物的主要成分的协同效应密切相关。

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研究结论

嗜热毁丝霉依赖于来自GH5_5和GH7的典型纤维素酶和来自AA9的辅助氧化酶LPMO进行纤维素解聚。基于肽质量指纹图谱分析和相应的基因敲除菌株研究，MtCel7A和MtCel5A被证明是参与纤维素降解的核心纤维素分解酶。此外，核心纤维素分解酶和不同类型的MtLPMO之间的协同作用表明，混合物C1/C4氧化LPMO在未来设计新型纤维素分解酶混合物中的潜在应用，该混合物可有效地将纤维素转化为纤维寡糖。

参考文献：

Qin X, Zou J, Yang K, Li J, Wang X, Tu T, Wang Y, Yao B, Huang H, Luo H. Deciphering the efficient cellulose degradation by the thermophilic fungus Myceliophthora thermophila focused on the synergistic action of glycoside hydrolases and lytic polysaccharide monooxygenases. Bioresour Technol. 2022 Sep 26;364:128027. doi: 10.1016/j.biortech.2022.128027. Epub ahead of print. PMID: 36174898.